人丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1）黴聯免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的︰本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1）的活性。
實驗原理︰
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1）水平。用純化的人丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-黴標抗體復合物，經過徹底洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP黴的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1）呈 喙亍Ｓ妹副暌竊 span>450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人丙酮酸脫氫黴激黴1（PDK1）活性。
試劑盒組成︰
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片
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2片
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密封袋
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1個
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1個
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黴標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.3ml×6管
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0.3ml×6管
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2-8℃保存
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黴標試劑
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5 ml×1瓶
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10 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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20×濃縮洗滌液
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15ml×1瓶
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25ml×1瓶
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2-8℃保存
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注︰標準品濃度依次為︰8、4、2、1、0.5、0 U/L.
樣本處理及要求︰
1. 血清︰室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。
2. 血漿︰應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘後，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。
3. 尿液︰用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行 span>
4. 細胞培養上清︰檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞並放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。
5. 組織標本︰切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本 杉 缶≡緗 刑崛。 崛“聰喙匚南捉 校 崛『笥 】旖 惺笛欏Ｈ舨荒藶砩轄 惺匝椋 將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物黴的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的加樣︰設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
2. 加樣︰分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及黴標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在黴標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于黴標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加黴︰每孔加入黴標試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育︰用封板膜封板後置37℃溫育60分鐘。
5. 配液︰將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋後備用。
6. 洗滌︰小心揭 舴獍迥? ?禾澹 干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重復5次，拍干。
7. 顯色︰每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
8. 終止︰每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9. 測定︰以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鐘以內進行。
注意事項︰
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘後方可使用，黴標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每 尾舛 耐 弊 標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請 詈蟪艘宰 稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以黴標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算︰
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能︰
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。
檢測範圍︰
0.25 U/L - 8 U/L
靈敏度︰
最低檢測濃度小于0.1 U/L
保存條件及有效期︰
1.試劑盒保存︰ 2-8℃。
2．有效期︰ 6個月
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上海丹施生物經過不斷的實驗優化和改進，積累了很多的經驗，擁有專業的丹施生物研發團隊。利用專業的免疫技術自主研發的elisa試劑盒，能對血清及其它樣本定量檢測抗原，定性檢測特異性抗體。優質的試劑，先進的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA檢測的方便性、穩定性、重復性和可靠性方面都具有很大的優勢。
ELISA檢測技術服務內容︰
1、雙抗體夾心法檢測抗原
2、間接法檢測抗體
3、為客戶提供各種ELISA技術進行樣本檢測。
二、樣本要求
在收集標本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。我們提倡新鮮標本盡早檢測，對收集後當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，請造模取材後，將標本及時分裝後放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質量，所以避免反復凍融。代測放免標本的客戶取材前須向我司銷售人員索要說明書，具體操作注意事項請與我司技術人員溝通。
液體類標本︰標本必須為液體，不含沉澱。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清、組織勻漿等。
血清︰室溫血液自然凝固10-20分鐘後，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。收集上清。如有沉澱形成，應再次離心。
血漿︰應根據試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10%（v/v）抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1%heparin
或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘後，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。如有沉澱形成，應再次離心。
尿液、胸腹水、腦脊液︰用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。如有沉澱形成，應再次離心。
細胞培養上清︰檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.0-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞並放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。
組織標本︰切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，緩沖液中可加入1μg/L蛋白黴抑制劑或50U/ml的Aprotinin（抑 黴）。用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清置于-20度或-70度保存，如有必要，可以將樣品濃縮干燥。分裝後一份待檢測，其余冷凍備用。
三、寄標本時需注明以下情況︰
1、標本編號；2、所測項目；3、是否做復孔；3、聯系方式；4、實驗後標本是否寄回。
客戶須知︰
客戶應對所提供的材料及信息負責，如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
